forked from YongxinLiu/EasyAmplicon
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# 易扩增子EasyAmplicon
# 作者 Authors: 刘永鑫(Yong-Xin Liu), 陈同(Tong Chen)等
# 版本 Version: v1.21
# 更新 Update: 2024-4-12
# 系统要求 System requirement: Windows 10+ / Mac OS 10.12+ / Ubuntu 20.04+
# 引文 Reference: Liu, et al. 2023. EasyAmplicon: An easy-to-use, open-source, reproducible, and community-based
# pipeline for amplicon data analysis in microbiome research. iMeta 2: e83. https://doi.org/10.1002/imt2.83
# 设置工作(work directory, wd)和软件数据库(database, db)目录
# 添加环境变量，并进入工作目录 Add environmental variables and enter work directory
# **每次打开Rstudio必须运行下面4行 Run it**，可选替换${db}为EasyMicrobiome安装位置
wd=/d/amplicon
db=/d/EasyMicrobiome
PATH=$PATH:${db}/win
cd ${wd}
## 1. 起始文件 start files
# 1. 分析流程pipeline.sh
# 2. 样本元信息metadata.txt，保存于result目录
# 3. 测序数据fastq文件保存于seq目录，通常以`.fq.gz`结尾，每个样品一对文件
# 4. 创建临时文件存储目录，分析结束可删除
mkdir -p seq result temp
### 1.1. 元数据/实验设计 metadata
# 准备样本元数据result/metadata.txt
# csvtk统计表行(样本数，不含表头)列数，-t设置列分隔为制表符，默认为;
csvtk -t stat result/metadata_raw.txt
# 元数据至少3列，首列为样本ID(SampleID)，结尾列为描述(Description)
# cat查看文件，-A显示符号，"|"为管道符实现命令连用，head显示文件头，-n3控制范围前3行
cat -A result/metadata_raw.txt | head -n3
# windows用户结尾有^M，运行sed命令去除，再用cat -A检查
sed 's/\r//' result/metadata_raw.txt > result/metadata.txt
cat -A result/metadata.txt | head -n3
### 1.2. 测序数据 sequencing data
# # 本段代码可在RStudio中Ctrl + Shift + C 取消注释“#”后运行
# # (可选)下载测序数据，按GSA的CRA(批次)和CRR(样品)编号下载数据
# # 示例下载单个文件并改名
# mkdir -p seq
# wget -c ftp://download.big.ac.cn/gsa/CRA002352/CRR117575/CRR117575_f1.fq.gz -O seq/KO1_1.fq.gz
# # 按实验设计编号批量下载并改名
# awk '{system("wget -c ftp://download.big.ac.cn/gsa/"$5"/"$6"/"$6"_f1.fq.gz -O seq/"$1"_1.fq.gz")}' \
# <(tail -n+2 result/metadata.txt)
# awk '{system("wget -c ftp://download.big.ac.cn/gsa/"$5"/"$6"/"$6"_r2.fq.gz -O seq/"$1"_2.fq.gz")}' \
# <(tail -n+2 result/metadata.txt)
# 公司返回的测序结果，通常为一个样品一对fq/fastq.gz格式压缩文件
# 文件名与样品名务必对应：不一致时手工修改，批量改名见"常见问题6"
# 如果测序数据是.gz的压缩文件，有时需要使用gunzip解压后使用，vsearch通常可直接读取压缩文件
# gunzip seq/*.gz
# zless按页查看压缩文件，空格翻页、q退出；head默认查看前10行，-n指定行
ls -sh seq/
zless seq/KO1_1.fq.gz | head -n4
# 每行太长，指定查看每行的1-60个字符
zless seq/KO1_1.fq | head | cut -c 1-60
# 统计测序数据，依赖seqkit程序
seqkit stat seq/KO1_1.fq.gz
# 批量统计测序数据并汇总表
seqkit stat seq/*.fq.gz > result/seqkit.txt
head result/seqkit.txt
### 1.3. 流程和数据库 pipeline & database
# 数据库第一次使用必须解压，以后可跳过此段
# usearchs可用16S/18S/ITS数据库：RDP, SILVA和UNITE，本地文件位置 ${db}/usearch/
# usearch数据库database下载页: http://www.drive5.com/usearch/manual/sintax_downloads.html
# 解压16S RDP数据库，gunzip解压缩，seqkit stat统计
# 保留原始压缩文件
gunzip -c ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa.gz > ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa
seqkit stat ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa # 2.1万条序列
# 解压ITS UNITE数据库，需自行从官网或网盘db/amplicon/usearch中下载
# gunzip -c ${db}/usearch/utax_reference_dataset_all_25.07.2023.fasta.gz >${db}/usearch/unite.fa
# seqkit stat ${db}/usearch/unite.fa # 32.6万
# Greengene数据库用于功能注释: ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
# 默认解压会删除原文件，-c指定输出至屏幕，> 写入新文件(可改名)
gunzip -c ${db}/gg/97_otus.fasta.gz > ${db}/gg/97_otus.fa
seqkit stat ${db}/gg/97_otus.fa
## 2. 序列合并和重命名 reads merge and rename
### 2.1 合并双端序列并按样品重命名 Merge pair-end reads and rename
#测试.以WT1单样品合并为例
#time统计计算时间，real是物理时间，user是计算时间，sys是硬件等待时间
# time vsearch --fastq_mergepairs seq/WT1_1.fq.gz \
# --reverse seq/WT1_2.fq.gz \
# --fastqout temp/WT1.merged.fq \
# --relabel WT1.
# head temp/WT1.merged.fq
#依照实验设计批处理并合并
#tail -n+2去表头，cut -f1取第一列，获得样本列表；18个样本x1.5万对序列合并8s
#Win下复制Ctrl+C为Linux下中止，为防止异常中断，结尾添加&转后台，无显示后按回车继续
# 一部分电脑 rush 不支持，运行时调度失败，请使用 for 循环部分
# for 循环部分是放入后台运行的，点完 run 之后，看上去程序已运行完，实际没运行完，而是正在运行中。
# 不要急于运行后面的程序。
# 之前课程，有发现每次运行结果都不一样，就是因为 for 循环部分没运行完，只生成了部分数据，导致后面
# 每个样品 reads 数每次运行都会不一致。
#方法1.for循环顺序处理
# time for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
# vsearch --fastq_mergepairs seq/${i}_1.fq.gz --reverse seq/${i}_2.fq.gz \
# --fastqout temp/${i}.merged.fq --relabel ${i}.
# done &
# 一部分电脑 rush 不支持，运行时调度失败，请使用 for 循环部分
#方法2.rush并行处理，任务数jobs(j),2可加速1倍4s；建议设置2-4
time tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f 1 | \
rush -j 2 "vsearch --fastq_mergepairs seq/{}_1.fq.gz --reverse seq/{}_2.fq.gz \
--fastqout temp/{}.merged.fq --relabel {}."
# 检查最后一个文件前10行中样本名
head temp/`tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f 1 | tail -n1`.merged.fq | grep ^@
##方法3.不支持压缩文件时解压再双端合并
# time tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f 1 | \
# rush -j 1 "vsearch --fastq_mergepairs <(zcat seq/{}_1.fq.gz) --reverse <(zcat seq/{}_2.fq.gz) \
# --fastqout temp/{}.merged.fq --relabel {}."
#
# time for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
# vsearch --fastq_mergepairs <(zcat seq/${i}_1.fq.gz) --reverse <(zcat seq/${i}_2.fq.gz) \
# --fastqout temp/${i}.merged.fq --relabel ${i}.
# done &
### 2.2 (可选)单端文件改名 Single-end reads rename
# # 单个序列改名示例
# i=WT1
# gunzip -c seq/${i}_1.fq.gz > seq/${i}.fq
# usearch -fastx_relabel seq/${i}.fq -fastqout temp/${i}.merged.fq -prefix ${i}.
#
# # 批量改名，需要有单端fastq文件，且解压(usearch不支持压缩格式)
# gunzip seq/*.gz
# time for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
# usearch -fastx_relabel seq/${i}.fq -fastqout temp/${i}.merged.fq -prefix ${i}.
# done &
# # vsearch大数据方法参考“常见问题2”
### 2.3 改名后序列整合 integrate renamed reads
#合并所有样品至同一文件
cat temp/*.merged.fq > temp/all.fq
#查看文件大小223M，软件不同版本结果略有差异
ls -lsh temp/all.fq
# 查看序列名，“.”之前是否为样本名，样本名绝不允许有点 (".")
# 样本名有点 (.) 的一个显著特征是生成的特征表会很大，特征表里面列很多，导致后面分析出现内存不足。
# 后面分析获得特征表后要看一眼有没有问题，遇到内存不足问题，也要回头来排查。
head -n 6 temp/all.fq|cut -c1-60
## 3. 切除引物与质控 Cut primers and quality filter
# 左端10bp标签+19bp上游引物V5共为29，右端V7为18bp下游引物
# Cut barcode 10bp + V5 19bp in left and V7 18bp in right
# 务必清楚实验设计和引物长度，引物已经去除可填0，27万条序列14s
time vsearch --fastx_filter temp/all.fq \
--fastq_stripleft 29 --fastq_stripright 18 \
--fastq_maxee_rate 0.01 \
--fastaout temp/filtered.fa
# 查看文件了解fa文件格式
head temp/filtered.fa
## 4. 去冗余挑选OTU/ASV Dereplicate and cluster/denoise
### 4.1 序列去冗余 Dereplicate
# 并添加miniuniqusize最小为8或1/1M，去除低丰度噪音并增加计算速度
# -sizeout输出丰度, --relabel必须加序列前缀更规范, 1s
vsearch --derep_fulllength temp/filtered.fa \
--minuniquesize 10 --sizeout --relabel Uni_ \
--output temp/uniques.fa
#高丰度非冗余序列非常小(500K~5M较适合)，名称后有size和频率
ls -lsh temp/uniques.fa
# Uni_1;size=6423 - 去冗余后序列的名字 Uni_1；该序列在所有样品测序数据中出现 6423 次
# 为出现最多的序列。
head -n 2 temp/uniques.fa
### 4.2 聚类OTU/去噪ASV Cluster or denoise
#有两种方法：推荐unoise3去噪获得单碱基精度ASV，备选传统的97%聚类OTU(属水平精度)
#usearch两种特征挑选方法均自带de novo去嵌合体
#-minsize二次过滤，控制OTU/ASV数量至1-5千，方便下游统计分析
#方法1. 97%聚类OTU，适合大数据/ASV规律不明显/reviewer要求
#结果耗时1s, 产生508 OTUs, 去除126 chimeras
# usearch -cluster_otus temp/uniques.fa -minsize 10 \
# -otus temp/otus.fa \
# -relabel OTU_
#方法2. ASV去噪 Denoise: predict biological sequences and filter chimeras
#6s, 1530 good, 41 chimeras, 序列百万条可能需要几天/几周
usearch -unoise3 temp/uniques.fa -minsize 10 \
-zotus temp/zotus.fa
#修改序列名：Zotu为改为ASV方便识别
sed 's/Zotu/ASV_/g' temp/zotus.fa > temp/otus.fa
head -n 2 temp/otus.fa
#方法3. 数据过大无法使用usearch时，备选vsearch方法见"常见问题3"
### 4.3 基于参考去嵌合 Reference-based chimera detect
# 不推荐，容易引起假阴性，因为参考数据库无丰度信息
# 而de novo时要求亲本丰度为嵌合体16倍以上防止假阴性
# 因为已知序列不会被去除，数据库选择越大越合理，假阴性率最低
mkdir -p result/raw
# 方法1. vsearch+rdp去嵌合(快但容易假阴性)
vsearch --uchime_ref temp/otus.fa \
-db ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa \
--nonchimeras result/raw/otus.fa
# RDP: 7s, 143 (9.3%) chimeras; SILVA：9m, 151 (8.4%) chimeras
# Win vsearch结果添加了windows换行符^M需删除，mac不要执行此命令
sed -i 's/\r//g' result/raw/otus.fa
# 方法2. 不去嵌合
# cp -f temp/otus.fa result/raw/otus.fa
## 5. 特征表构建和筛选 Feature table create and filter
# OTU和ASV统称为特征(Feature)，它们的区别是：
# OTU通常按97%聚类后挑选最高丰度或中心的代表性序列；
# ASV是基于序列进行去噪(排除或校正错误序列，并挑选丰度较高的可信序列)作为代表性序列
### 5.1 生成特征表
# id(1)：100%相似度比对49.45%序列，1m50s
# id(0.97)：97%相似度比对83.66%序列，1m10s(更高数据使用率，更快)
time vsearch --usearch_global temp/filtered.fa \
--db result/raw/otus.fa \
--id 0.97 --threads 4 \
--otutabout result/raw/otutab.txt
#212862 of 268019 (79.42%)可比对
# vsearch结果windows用户删除换行符^M校正为标准Linux格式
sed -i 's/\r//' result/raw/otutab.txt
head -n6 result/raw/otutab.txt | cut -f 1-6 |cat -A
# csvtk统计表行列
# 这里一定看好列数，是不是等于你的样品数；如果不等，一般是样品命名存在问题，具体看上面解释
csvtk -t stat result/raw/otutab.txt
### 5.2 物种注释和去除质体和非细菌 Remove plastid and non-Bacteria
# 物种注释-去除质体和非细菌/古菌并统计比例(可选)
# RDP物种注释(rdp_16s_v18)更快，但缺少完整真核来源数据,可能不完整，耗时15s;
# SILVA数据库(silva_16s_v123.fa)更好注释真核、质体序列，极慢耗时3h起
# 置信阈值通常0.6/0.8，vserch最低0.1/usearch可选0输出最相似物种注释用于观察潜在分类
vsearch --sintax result/raw/otus.fa \
--db ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa \
--sintax_cutoff 0.1 \
--tabbedout result/raw/otus.sintax
sed -i 's/\r//' result/raw/otus.sintax
# 方法1. 原始特征表行数
wc -l result/raw/otutab.txt
#R脚本选择细菌古菌(真核)、去除叶绿体、线粒体并统计比例；输出筛选并排序的OTU表
#输入为OTU表result/raw/otutab.txt和物种注释result/raw/otus.sintax
#输出筛选并排序的特征表result/otutab.txt和
#统计污染比例文件result/raw/otutab_nonBac.txt和过滤细节otus.sintax.discard
#真菌ITS数据，请改用otutab_filter_nonFungi.R脚本，只筛选真菌
# Rscript ${db}/script/otutab_filter_nonBac.R -h # 显示参数说明
Rscript ${db}/script/otutab_filter_nonBac.R \
--input result/raw/otutab.txt \
--taxonomy result/raw/otus.sintax \
--output result/otutab.txt\
--stat result/raw/otutab_nonBac.stat \
--discard result/raw/otus.sintax.discard
# 筛选后特征表行数
wc -l result/otutab.txt
#过滤特征表对应序列
cut -f 1 result/otutab.txt | tail -n+2 > result/otutab.id
usearch -fastx_getseqs result/raw/otus.fa \
-labels result/otutab.id -fastaout result/otus.fa
#过滤特征表对应序列注释
awk 'NR==FNR{a[$1]=$0}NR>FNR{print a[$1]}'\
result/raw/otus.sintax result/otutab.id \
> result/otus.sintax
# 方法2. 觉得筛选不合理可以不筛选
# cp result/raw/otu* result/
#可选统计方法：OTU表简单统计 Summary OTUs table
usearch -otutab_stats result/otutab.txt \
-output result/otutab.stat
cat result/otutab.stat
#注意最小值、分位数，或查看result/raw/otutab_nonBac.stat中样本详细数据量，用于重采样
### 5.3 等量抽样标准化
# Normlize by subsample
#使用vegan包进行等量重抽样，输入reads count格式Feature表result/otutab.txt
#可指定输入文件、抽样量和随机数，输出抽平表result/otutab_rare.txt和多样性alpha/vegan.txt
mkdir -p result/alpha
Rscript ${db}/script/otutab_rare.R --input result/otutab.txt \
--depth 10000 --seed 1 \
--normalize result/otutab_rare.txt \
--output result/alpha/vegan.txt
usearch -otutab_stats result/otutab_rare.txt \
-output result/otutab_rare.stat
cat result/otutab_rare.stat
## 6. α多样性 alpha diversity
### 6.1. 计算α多样性 calculate alpha diversity
# 使用USEARCH计算14种alpha多样性指数(Chao1有错勿用)
#details in http://www.drive5.com/usearch/manual/alpha_metrics.html
usearch -alpha_div result/otutab_rare.txt \
-output result/alpha/alpha.txt
### 6.2. 计算稀释丰富度 calculate rarefaction richness
#稀释曲线：取1%-100%的序列中OTUs数量，每次无放回抽样
#Rarefaction from 1%, 2% .. 100% in richness (observed OTUs)-method without_replacement https://drive5.com/usearch/manual/cmd_otutab_subsample.html
usearch -alpha_div_rare result/otutab_rare.txt \
-output result/alpha/alpha_rare.txt \
-method without_replacement
#预览结果
head -n2 result/alpha/alpha_rare.txt
#样本测序量低出现非数值"-"的处理，详见常见问题8
sed -i "s/-/\t0.0/g" result/alpha/alpha_rare.txt
### 6.3. 筛选高丰度菌 Filter by abundance
#计算各特征的均值，有组再求分组均值，需根据实验设计metadata.txt修改组列名
#输入文件为feautre表result/otutab.txt，实验设计metadata.txt
#输出为特征表按组的均值-一个实验可能有多种分组方式
#-h显示脚本帮助(参数说明)
Rscript ${db}/script/otu_mean.R -h
#scale是否标准化，zoom标准化总和，all输出全部样本均值，type计算类型mean或sum
Rscript ${db}/script/otu_mean.R --input result/otutab.txt \
--metadata result/metadata.txt \
--group Group --thre 0 \
--scale TRUE --zoom 100 --all TRUE --type mean \
--output result/otutab_mean.txt
# 结果为全部和各组均值
head -n3 result/otutab_mean.txt
#如以平均丰度>0.1%筛选，可选0.5或0.05，得到每个组的OTU组合
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if(FNR==1) {for(i=3;i<=NF;i++) a[i]=$i; print "OTU","Group";} \
else {for(i=3;i<=NF;i++) if($i>0.1) print $1, a[i];}}' \
result/otutab_mean.txt > result/alpha/otu_group_exist.txt
head result/alpha/otu_group_exist.txt
cut -f 2 result/alpha/otu_group_exist.txt | sort | uniq -c
# 试一试：不同丰度下各组有多少OTU/ASV
# 可在 http://ehbio.com/test/venn/ 中绘图并显示各组共有和特有维恩或网络图
# 也可在 https://www.bic.ac.cn/ImageGP 或 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 绘制Venn、upSetView和Sanky
## 7. β多样性 Beta diversity
#结果有多个文件，需要目录
mkdir -p result/beta/
#基于OTU构建进化树 Make OTU tree, 4s
usearch -cluster_agg result/otus.fa -treeout result/otus.tree
#生成5种距离矩阵：bray_curtis, euclidean, jaccard, manhatten, unifrac
usearch -beta_div result/otutab_rare.txt -tree result/otus.tree \
-filename_prefix result/beta/
## 8. 物种注释分类汇总
#OTU对应物种注释2列格式：去除sintax中置信值，只保留物种注释，替换:为_，删除引号
cut -f 1,4 result/otus.sintax \
|sed 's/\td/\tk/;s/:/__/g;s/,/;/g;s/"//g' \
> result/taxonomy2.txt
head -n3 result/taxonomy2.txt
#OTU对应物种8列格式：注意注释是非整齐
#生成物种表格OTU/ASV中空白补齐为Unassigned
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{delete a; a["k"]="Unassigned";a["p"]="Unassigned";a["c"]="Unassigned";a["o"]="Unassigned";a["f"]="Unassigned";a["g"]="Unassigned";a["s"]="Unassigned";\
split($2,x,";");for(i in x){split(x[i],b,"__");a[b[1]]=b[2];} \
print $1,a["k"],a["p"],a["c"],a["o"],a["f"],a["g"],a["s"];}' \
result/taxonomy2.txt > temp/otus.tax
sed 's/;/\t/g;s/.__//g;' temp/otus.tax|cut -f 1-8 | \
sed '1 s/^/OTUID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' \
> result/taxonomy.txt
head -n3 result/taxonomy.txt
#统计门纲目科属，使用 rank参数 p c o f g，为phylum, class, order, family, genus缩写
mkdir -p result/tax
for i in p c o f g;do
usearch -sintax_summary result/otus.sintax \
-otutabin result/otutab_rare.txt -rank ${i} \
-output result/tax/sum_${i}.txt
done
sed -i 's/(//g;s/)//g;s/\"//g;s/\#//g;s/\/Chloroplast//g' result/tax/sum_*.txt
# 列出所有文件
wc -l result/tax/sum_*.txt
head -n3 result/tax/sum_g.txt
## 9. 有参定量特征表
# 比对Greengenes97% OTUs比对，用于PICRUSt/Bugbase功能预测
mkdir -p result/gg/
# usearch比对更快，但文件超限报错选附录14 vsearch比对
# 默认10核以下使用1核，10核以上使用10核
usearch -otutab temp/filtered.fa -otus ${db}/gg/97_otus.fa \
-otutabout result/gg/otutab.txt -threads 4
# 比对率80.0%, 1核11m，4核3m，10核2m，内存使用743Mb
head -n3 result/gg/otutab.txt
#统计
usearch -otutab_stats result/gg/otutab.txt -output result/gg/otutab.stat
cat result/gg/otutab.stat
## 10. 空间清理及数据提交
#删除中间大文件
rm -rf temp/*.fq
# 分双端统计md5值，用于数据提交
cd seq
md5sum *_1.fq.gz > md5sum1.txt
md5sum *_2.fq.gz > md5sum2.txt
paste md5sum1.txt md5sum2.txt | awk '{print $2"\t"$1"\t"$4"\t"$3}' | sed 's/*//g' > ../result/md5sum.txt
rm md5sum*
cd ..
cat result/md5sum.txt
# R语言多样性和物种组成分析
## 1. Alpha多样性
### 1.1 Alpha多样性箱线图
# 在线绘图平台 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供更多定制参数和绘制灵活性
# 查看帮助
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R -h
# 完整参数，多样性指数可选richness chao1 ACE shannon simpson invsimpson
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index richness \
--input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --output result/alpha/ \
--width 89 --height 59
# 使用循环绘制6种常用指数
for i in `head -n1 result/alpha/vegan.txt|cut -f 2-`;do
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index ${i} \
--input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --output result/alpha/ \
--width 89 --height 59
done
mv alpha_boxplot_TukeyHSD.txt result/alpha/
# 每个指数下两两比较的P值
cat result/alpha/alpha_boxplot_TukeyHSD.txt
# Alpha多样性柱状图+标准差
Rscript ${db}/script/alpha_barplot.R --alpha_index richness \
--input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --output result/alpha/ \
--width 89 --height 59
### 1.2 稀释曲线
Rscript ${db}/script/alpha_rare_curve.R \
--input result/alpha/alpha_rare.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --output result/alpha/ \
--width 120 --height 59
### 1.3 多样性维恩图
# 三组比较:-f输入文件,-a/b/c/d/g分组名,-w/u为宽高英寸,-p输出文件名后缀
bash ${db}/script/sp_vennDiagram.sh \
-f result/alpha/otu_group_exist.txt \
-a WT -b KO -c OE \
-w 3 -u 3 \
-p WT_KO_OE
# 四组比较，图和代码见输入文件目录，运行目录为当前项目根目录
bash ${db}/script/sp_vennDiagram.sh \
-f result/alpha/otu_group_exist.txt \
-a WT -b KO -c OE -d All \
-w 3 -u 3 \
-p WT_KO_OE_All
# EVenn在线绘制维恩图 https://www.ehbio.com/test/venn
## 2. Beta多样性
### 2.1 距离矩阵热图pheatmap
# 在线绘图平台 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供更多定制参数和绘制灵活性
# 添加分组注释，如2，4列的基因型和地点
cut -f 1-2 result/metadata.txt > temp/group.txt
# 以bray_curtis为例，-f输入文件,-h是否聚类TRUE/FALSE,-u/v为宽高英寸
# -P添加行注释文件，-Q添加列注释
bash ${db}/script/sp_pheatmap.sh \
-f result/beta/bray_curtis.txt \
-H 'TRUE' -u 6.9 -v 5.6 \
-P temp/group.txt -Q temp/group.txt
### 2.2 主坐标分析PCoA
# 在线绘图平台 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供更多定制参数和绘制灵活性
# 输入文件，选择分组，输出文件，图片尺寸mm，统计见beta_pcoa_stat.txt
Rscript ${db}/script/beta_pcoa.R \
--input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --label FALSE --width 89 --height 59 \
--output result/beta/bray_curtis.pcoa.pdf
# 添加样本标签 --label TRUE
Rscript ${db}/script/beta_pcoa.R \
--input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --label TRUE --width 89 --height 59 \
--output result/beta/bray_curtis.pcoa.label.pdf
mv beta_pcoa_stat.txt result/beta/
# 查看组间两两比较P值，概率事件每次略有不同
cat result/beta/beta_pcoa_stat.txt
### 2.3 限制性主坐标分析CPCoA
Rscript ${db}/script/beta_cpcoa.R \
--input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --output result/beta/bray_curtis.cpcoa.pdf \
--width 89 --height 59
# 添加样本标签 --label TRUE
Rscript ${db}/script/beta_cpcoa.R \
--input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --label TRUE --width 89 --height 59 \
--output result/beta/bray_curtis.cpcoa.label.pdf
## 3. 物种组成Taxonomy
### 3.1 堆叠柱状图Stackplot
# 在线绘图平台 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供更多定制参数和绘制灵活性
# 以门(p)水平为例，结果包括output.sample/group.pdf两个文件
Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R \
--input result/tax/sum_p.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --color ggplot --legend 7 --width 89 --height 59 \
--output result/tax/sum_p.stackplot
# 修改颜色--color ggplot, manual1(22), Paired(12) or Set3(12)
Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R \
--input result/tax/sum_p.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --color Paired --legend 12 --width 181 --height 119 \
--output result/tax/sum_p.stackplotPaired
# 批量绘制输入包括p/c/o/f/g共5级
for i in p c o f g; do
Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R \
--input result/tax/sum_${i}.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --output result/tax/sum_${i}.stackplot \
--legend 8 --width 89 --height 59; done
### 3.2 弦/圈图circlize
# 以纲(class,c)为例，绘制前5组
i=c
Rscript ${db}/script/tax_circlize.R \
--input result/tax/sum_${i}.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --legend 5
# 结果位于当前目录circlize.pdf(随机颜色)，circlize_legend.pdf(指定颜色+图例)
# 移动并改名与分类级一致
mv circlize.pdf result/tax/sum_${i}.circlize.pdf
mv circlize_legend.pdf result/tax/sum_${i}.circlize_legend.pdf
### 3.3 树图treemap(参考)
# 多层级包含物种关系，输入特征表和物种注释，输出树图
# 指定包含特征数量和图片宽高，100个ASV耗时12s
Rscript ${db}/script/tax_maptree.R \
--input result/otutab.txt --taxonomy result/taxonomy.txt \
--output result/tax/tax_maptree.pdf \
--topN 100 --width 183 --height 118
# 24、差异比较
## 1. R语言差异分析
### 1.1 差异比较
# Error in file(file, ifelse(append, "a", "w")),输出目录不存在，创建目录即可
mkdir -p result/compare/
# 输入特征表、元数据；指定分组列名、比较组和丰度
# 选择方法 wilcox/t.test/edgeR、pvalue和fdr和输出目录
compare="KO-WT"
Rscript ${db}/script/compare.R \
--input result/otutab.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --compare ${compare} --threshold 0.1 \
--method edgeR --pvalue 0.05 --fdr 0.2 \
--output result/compare/
### 1.2 火山图
# 输入compare.R的结果，输出火山图带数据标签，可指定图片大小
Rscript ${db}/script/compare_volcano.R \
--input result/compare/${compare}.txt \
--output result/compare/${compare}.volcano.pdf \
--width 89 --height 59
### 1.3 热图
# 输入compare.R的结果，筛选列数，指定元数据和分组、物种注释，图大小英寸和字号
bash ${db}/script/compare_heatmap.sh -i result/compare/${compare}.txt -l 7 \
-d result/metadata.txt -A Group \
-t result/taxonomy.txt \
-w 8 -h 5 -s 7 \
-o result/compare/${compare}
### 1.4 曼哈顿图
# i差异比较结果,t物种注释,p图例,w宽,v高,s字号,l图例最大值
# 图例显示不图，可增加高度v为119+即可，后期用AI拼图为KO-WT.heatmap.emf
bash ${db}/script/compare_manhattan.sh -i result/compare/${compare}.txt \
-t result/taxonomy.txt \
-p result/tax/sum_p.txt \
-w 183 -v 59 -s 7 -l 10 \
-o result/compare/${compare}.manhattan.p.pdf
# 上图只有6个门，切换为纲c和-L Class展示细节
bash ${db}/script/compare_manhattan.sh -i result/compare/${compare}.txt \
-t result/taxonomy.txt \
-p result/tax/sum_c.txt \
-w 183 -v 59 -s 7 -l 10 -L Class \
-o result/compare/${compare}.manhattan.c.pdf
# 显示完整图例，再用AI拼图
bash ${db}/script/compare_manhattan.sh -i result/compare/${compare}.txt \
-t result/taxonomy.txt \
-p result/tax/sum_c.txt \
-w 183 -v 149 -s 7 -l 10 -L Class \
-o result/compare/${compare}.manhattan.c.legend.pdf
### 1.5 单个特征的绘制
# 筛选显示差异ASV，按KO组丰度降序列，取ID展示前10
awk '$4<0.05' result/compare/KO-WT.txt | sort -k7,7nr | cut -f1 | head
# 差异OTU细节展示
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index ASV_2 \
--input result/otutab.txt --design result/metadata.txt \
--transpose TRUE --scale TRUE \
--width 89 --height 59 \
--group Group --output result/compare/feature_
# ID不存在会报错： Error in data.frame(..., check.names = FALSE) : 参数值意味着不同的行数: 0, 18 Calls: alpha_boxplot -> cbind -> cbind -> data.frame
# 指定某列排序：按属丰度均值All降序
csvtk -t sort -k All:nr result/tax/sum_g.txt | head
# 差属细节展示
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index Lysobacter \
--input result/tax/sum_g.txt --design result/metadata.txt \
--transpose TRUE \
--width 89 --height 59 \
--group Group --output result/compare/feature_
### 1.5 三元图
#参考示例见：result\compare\ternary\ternary.Rmd 文档
#备选教程[246.三元图的应用与绘图实战](https://mp.weixin.qq.com/s/3w3ncpwjQaMRtmIOtr2Jvw)
## 2. STAMP输入文件准备
### 2.1 生成输入文件
Rscript ${db}/script/format2stamp.R -h
mkdir -p result/stamp
Rscript ${db}/script/format2stamp.R --input result/otutab.txt \
--taxonomy result/taxonomy.txt --threshold 0.01 \
--output result/stamp/tax
# 可选Rmd文档见result/format2stamp.Rmd
### 2.2 绘制扩展柱状图和表
compare="KO-WT"
# 替换ASV(result/otutab.txt)为属(result/tax/sum_g.txt)
Rscript ${db}/script/compare_stamp.R \
--input result/stamp/tax_5Family.txt --metadata result/metadata.txt \
--group Group --compare ${compare} --threshold 0.1 \
--method "t.test" --pvalue 0.05 --fdr "none" \
--width 189 --height 159 \
--output result/stamp/${compare}
# 可选Rmd文档见result/CompareStamp.Rmd
## 3. LEfSe输入文件准备
### 3.1. 命令行生成文件
# 可选命令行生成输入文件
Rscript ${db}/script/format2lefse.R -h
mkdir -p result/lefse
# threshold控制丰度筛选以控制作图中的枝数量
Rscript ${db}/script/format2lefse.R --input result/otutab.txt \
--taxonomy result/taxonomy.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --threshold 0.4 \
--output result/lefse/LEfSe
### 3.2 Rmd生成输入文件(可选)
#1. result目录中存在otutab.txt, metadata.txt, taxonomy.txt三个文件；
#2. Rstudio打开EasyAmplicon中format2lefse.Rmd，另存至result目录并Knit生成输入文件和可重复计算网页；
### 3.3 LEfSe分析
#方法1. 打开LEfSe.txt并在线提交 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/analysis?tool_type=tool&page=b%27MzY%3D%27
#方法2. LEfSe本地分析(限Linux系统、选学)，参考代码见附录
#方法3. LEfSe官网在线使用
# 25、QIIME 2分析流程
# 代码详见 qiime2/pipeline_qiime2.sh
# 31、功能预测
## 1. PICRUSt功能预测
### PICRUSt 1.0
# 方法1. 使用 https://www.bic.ac.cn/ImageGP 在线分析 gg/otutab.txt
# 方法2. Linux服务器用户可参考"附录2. PICRUSt功能预测"实现软件安装和分析
# 然后结果使用STAMP/R进行差异比较
# R语言绘图
# 输入文件格式调整
l=L2
sed '/# Const/d;s/OTU //' result/picrust/all_level.ko.${l}.txt > result/picrust/${l}.txt
num=`head -n1 result/picrust/${l}.txt|wc -w`
paste <(cut -f $num result/picrust/${l}.txt) <(cut -f 1-$[num-1] result/picrust/${l}.txt) \
> result/picrust/${l}.spf
cut -f 2- result/picrust/${l}.spf > result/picrust/${l}.mat.txt
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} {print $2,$1}' result/picrust/${l}.spf | sed 's/;/\t/' | sed '1 s/ID/Pathway\tCategory/' \
> result/picrust/${l}.anno.txt
# 差异比较
compare="KO-WT"
Rscript ${db}/script/compare.R \
--input result/picrust/${l}.mat.txt --design result/metadata.txt \
--group Group --compare ${compare} --threshold 0 \
--method wilcox --pvalue 0.05 --fdr 0.2 \
--output result/picrust/
# 可对结果${compare}.txt筛选
# 绘制指定组(A/B)的柱状图，按高分类级着色和分面
Rscript ${db}/script/compare_hierarchy_facet.R \
--input result/picrust/${compare}.txt \
--data MeanA \
--annotation result/picrust/${l}.anno.txt \
--output result/picrust/${compare}.MeanA.bar.pdf
# 绘制两组显著差异柱状图，按高分类级分面
Rscript ${db}/script/compare_hierarchy_facet2.R \
--input result/picrust/${compare}.txt \
--pvalue 0.05 --fdr 0.1 \
--annotation result/picrust/${l}.anno.txt \
--output result/picrust/${compare}.bar.pdf
### PICRUSt 2.0
# 软件安装见附录6. PICRUSt环境导出和导入
# (可选)PICRUSt2(Linux/Windows下Linux子系统，要求>16GB内存)
# 安装参考附录5的方式直接下载安装包并解压即可使用
# Linux中加载conda环境
conda activate picrust2
# 进入工作目录，服务器要修改工作目录
wd=/mnt/d/amplicon/result/picrust2
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}
# 运行流程，内存15.7GB，耗时12m
picrust2_pipeline.py -s ../otus.fa -i ../otutab.txt -o ./out -p 8
# 添加EC/KO/Pathway注释
cd out
add_descriptions.py -i pathways_out/path_abun_unstrat.tsv.gz -m METACYC \
-o METACYC.tsv
add_descriptions.py -i EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz -m EC \
-o EC.tsv
add_descriptions.py -i KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz -m KO \
-o KO.tsv
# KEGG按层级合并
db=/mnt/d/EasyMicrobiome/
python3 ${db}/script/summarizeAbundance.py \
-i KO.tsv \
-m ${db}/kegg/KO1-4.txt \
-c 2,3,4 -s ',+,+,' -n raw \
-o KEGG
# 统计各层级特征数量
wc -l KEGG*
# 可视化见picrust2文件夹中ggpicrust2.Rmd
## 2. 元素循环FAPROTAX
## 方法1. 在线分析，推荐使用 http://www.bic.ac.cn/ImageGP/index.php/Home/Index/FAPROTAX.html 在线分析
## 方法2. Linux下分析、如QIIME 2环境下
# 设置工作目录
wd=/mnt/d/amplicon/result/faprotax/
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}
# 设置脚本目录
sd=/mnt/d/EasyMicrobiome/script/FAPROTAX_1.2.7
### 1. 软件安装
# 注：软件已经下载至 EasyMicrobiome/script目录，在qiime2环境下运行可满足依赖关系
#(可选)下载软件新版本，以1.2.7版为例， 2023/7/14更新数据库
#wget -c https://pages.uoregon.edu/slouca/LoucaLab/archive/FAPROTAX/SECTION_Download/MODULE_Downloads/CLASS_Latest%20release/UNIT_FAPROTAX_1.2.7/FAPROTAX_1.2.7.zip
#解压
#unzip FAPROTAX_1.2.7.zip
#新建一个python3环境并配置依赖关系，或进入qiime2 python3环境
conda activate qiime2-amplicon-2024.2
# source /home/silico_biotech/miniconda3/envs/qiime2/bin/activate
#测试是否可运行，弹出帮助即正常工作
python $sd/collapse_table.py
### 2. 制作输入OTU表
#txt转换为biom json格式
biom convert -i ../otutab_rare.txt -o otutab_rare.biom --table-type="OTU table" --to-json
#添加物种注释
biom add-metadata -i otutab_rare.biom --observation-metadata-fp ../taxonomy2.txt \
-o otutab_rare_tax.biom --sc-separated taxonomy \
--observation-header OTUID,taxonomy
#指定输入文件、物种注释、输出文件、注释列名、属性列名
### 3. FAPROTAX功能预测
#python运行collapse_table.py脚本、输入带有物种注释OTU表tax.biom、
#-g指定数据库位置，物种注释列名，输出过程信息，强制覆盖结果，结果文件和细节
#下载faprotax.txt，配合实验设计可进行统计分析
#faprotax_report.txt查看每个类别中具体来源哪些OTUs
python ${sd}/collapse_table.py -i otutab_rare_tax.biom \
-g ${sd}/FAPROTAX.txt \
--collapse_by_metadata 'taxonomy' -v --force \
-o faprotax.txt -r faprotax_report.txt
### 4. 制作OTU对应功能注释有无矩阵
# 对ASV(OTU)注释行，及前一行标题进行筛选
grep 'ASV_' -B 1 faprotax_report.txt | grep -v -P '^--$' > faprotax_report.clean
# faprotax_report_sum.pl脚本将数据整理为表格，位于public/scrit中
perl ${sd}/../faprotax_report_sum.pl -i faprotax_report.clean -o faprotax_report
# 查看功能有无矩阵，-S不换行
less -S faprotax_report.mat
## 3. Bugbase细菌表型预测
### 1. Bugbase命令行分析
cd ${wd}/result
bugbase=${db}/script/BugBase
rm -rf bugbase/
# 脚本已经优化适合R4.0，biom包更新为biomformat
Rscript ${bugbase}/bin/run.bugbase.r -L ${bugbase} \
-i gg/otutab.txt -m metadata.txt -c Group -o bugbase/
### 2. 其它可用分析
# 使用 http://www.bic.ac.cn/ImageGP/index.php/Home/Index/BugBase.html
# 官网，https://bugbase.cs.umn.edu/ ，有报错，不推荐
# Bugbase细菌表型预测Linux，详见附录3. Bugbase细菌表型预测
# 32、MachineLearning机器学习
# RandomForest包使用的R代码见advanced/RandomForestClassification和RandomForestRegression
## Silme2随机森林/Adaboost使用代码见EasyMicrobiome/script/slime2目录中的slime2.py，详见附录4
# 使用实战(使用QIIME 2的Python3环境，以在Windows中为例)
conda activate qiime2-amplicon-2024.2
cd /mnt/d/EasyMicrobiome/script/slime2
#使用adaboost计算10000次(16.7s)，推荐千万次
./slime2.py otutab.txt design.txt --normalize --tag ab_e4 ab -n 10000
#使用RandomForest计算10000次(14.5s)，推荐百万次，支持多线程
./slime2.py otutab.txt design.txt --normalize --tag rf_e4 rf -n 10000
# 33、Evolution进化树
cd ${wd}
mkdir -p result/tree
cd ${wd}/result/tree
## 1. 筛选高丰度/指定的特征
#方法1. 按丰度筛选特征，一般选0.001或0.005，且OTU数量在30-150个范围内
#统计特征表中ASV数量，如总计1609个
tail -n+2 ../otutab_rare.txt | wc -l
#按相对丰度0.2%筛选高丰度OTU
usearch -otutab_trim ../otutab_rare.txt \
-min_otu_freq 0.002 \
-output otutab.txt
#统计筛选OTU表特征数量，总计~81个
tail -n+2 otutab.txt | wc -l
#方法2. 按数量筛选
# #按丰度排序，默认由大到小
# usearch -otutab_sortotus ../otutab_rare.txt \
# -output otutab_sort.txt
# #提取高丰度中指定Top数量的OTU ID，如Top100,
# sed '1 s/#OTU ID/OTUID/' otutab_sort.txt \
# | head -n101 > otutab.txt
#修改特征ID列名
sed -i '1 s/#OTU ID/OTUID/' otutab.txt
#提取ID用于提取序列
cut -f 1 otutab.txt > otutab_high.id
# 筛选高丰度菌/指定差异菌对应OTU序列
usearch -fastx_getseqs ../otus.fa -labels otutab_high.id \
-fastaout otus.fa
head -n 2 otus.fa
## 筛选OTU对物种注释
awk 'NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print a[$1]}' ../taxonomy.txt \
otutab_high.id > otutab_high.tax
#获得OTU对应组均值，用于样本热图
#依赖之前otu_mean.R计算过按Group分组的均值
awk 'NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print a[$1]}' ../otutab_mean.txt otutab_high.id \
| sed 's/#OTU ID/OTUID/' > otutab_high.mean
head -n3 otutab_high.mean
#合并物种注释和丰度为注释文件
cut -f 2- otutab_high.mean > temp
paste otutab_high.tax temp > annotation.txt
head -n 3 annotation.txt
## 2. 构建进化树
# 起始文件为 result/tree目录中 otus.fa(序列)、annotation.txt(物种和相对丰度)文件
# Muscle软件进行序列对齐，3s
muscle -in otus.fa -out otus_aligned.fas
### 方法1. 利用IQ-TREE快速构建ML进化树，2m
rm -rf iqtree
mkdir -p iqtree
iqtree -s otus_aligned.fas \
-bb 1000 -redo -alrt 1000 -nt AUTO \
-pre iqtree/otus
### 方法2. FastTree快速建树(Linux)
# 注意FastTree软件输入文件为fasta格式的文件，而不是通常用的Phylip格式。输出文件是Newick格式。
# 该方法适合于大数据，例如几百个OTUs的系统发育树！
# Ubuntu上安装fasttree可以使用`apt install fasttree`
# fasttree -gtr -nt otus_aligned.fas > otus.nwk
## 3. 进化树美化
# 访问http://itol.embl.de/，上传otus.nwk，再拖拽下方生成的注释方案于树上即美化
## 方案1. 外圈颜色、形状分类和丰度方案
# annotation.txt OTU对应物种注释和丰度，
# -a 找不到输入列将终止运行（默认不执行）-c 将整数列转换为factor或具有小数点的数字，-t 偏离提示标签时转换ID列，-w 颜色带，区域宽度等， -D输出目录，-i OTU列名，-l OTU显示名称如种/属/科名，
# cd ${wd}/result/tree
Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -c double -D plan1 -i OTUID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
# 生成注释文件中每列为单独一个文件
## 方案2. 生成丰度柱形图注释文件
Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -d -c none -D plan2 -b Phylum -i OTUID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
## 方案3. 生成热图注释文件
Rscript ${db}/script/table2itol.R -c keep -D plan3 -i OTUID -t %s otutab.txt
## 方案4. 将整数转化成因子生成注释文件
Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -c factor -D plan4 -i OTUID -l Genus -t %s -w 0 annotation.txt
# 树iqtree/otus.contree在 http://itol.embl.de/ 上展示，拖拽不同Plan中的文件添加树注释
# 返回工作目录
cd ${wd}
## 4. 进化树可视化
https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供了更简易的可视化方式
# 附加视频
# 目录 Supp，网课有对应视频(可能编号不同，找关键字)
## S1. 网络分析R/CytoGephi
# 目录 Supp/S1NetWork
## S2. 溯源和马尔可夫链
# 目录 Supp/S2SourcetrackerFeastMarkov
## S11、网络分析ggClusterNet
# 代码：advanced/ggClusterNet/Practice.Rmd
## S12、Microeco包数据可视化
# 代码：advanced/microeco/Practice.Rmd
# 附录：Linux服务器下分析(选学)
#注：Windows下可能无法运行以下代码，推荐在Linux，或Windows下Linux子系统下conda安装相关程序
## 1. LEfSe分析
mkdir -p ~/amplicon/lefse
cd ~/amplicon/lefse
# format2lefse.Rmd代码制作或上传输入文件LEfSe.txt
# 安装lefse
# conda install lefse
#格式转换为lefse内部格式
lefse-format_input.py LEfSe.txt input.in -c 1 -o 1000000
#运行lefse